Neurotransmitter

Der ALEXYS Neurotransmitter Analyzer wurde für die Analyse von Hirngewebe, Fruchtfliegen oder Mikrodialyseproben entwickelt. Unsere Applikationen beschreiben die Herausforderungen, mit denen wir konfrontiert waren. Die Bilanz an Literaturveröffentlichungen beweist unseren Erfolg. Das ALEXYS basiert auf UHPLC mit elektrochemischer Detektion und verfügt über eine Reihe einzigartiger Eigenschaften, die es für die Forschung in den Neurowissenschaften geeignet machen. Der Entwicklungsprozess bestand in der Beseitigung von Engpässen und der Verbesserung der Systemleistung auf den heutigen Stand.

Erstens muss das System für die Handhabung kleiner Probenmengen geeignet sein. Dies ist besonders wichtig für Mikrodialyseproben. Bei der Mikrodialyse des Gehirns wird über eine Sonde extrazelluläre Flüssigkeit entnommen, und es werden Fraktionen für weitere Analysen gesammelt. Typische Flussraten in der Mikrodialyse sind 1 – 2 µL/min, eine Verringerung der Fraktionsgröße auf einige Mikroliter ermöglicht eine zeitliche Auflösung von einigen Minuten. Im ALEXYS-Autosampler wurden Injektionsverfahren entwickelt, die 5 von insgesamt 7 µL Probenvolumen aufnehmen. Und mit der Online-Mikrodialyse können Fraktionen von 2 µL direkt aus der Probensonde analysiert werden, wobei nur ein Probenventil verwendet wird. Es muss nicht erst in Fläschchen gesammelt und mit einem Autosampler injiziert werden. Dadurch ist eine zeitliche Auflösung von nur 1 Minute möglich.

Zweitens muss das System über eine ausgezeichnete Empfindlichkeit verfügen, um extrem niedrige Konzentrationen bestimmter Neurotransmitter quantifizieren zu können. Das ALEXYS verwendet eine Wall-Jet-Durchflusszelle mit einstellbaren Abständen, die SenCell. Nachweisgrenzen von bis zu 20 pmol/L für Dopamin, Serotonin und Noradrenalin sind bekannt (0,1 fmol). Für Acetylcholin ist ein Zwischenschritt mit einem Enzymreaktor nach der Säule erforderlich, und es kann eine Nachweisgrenze von etwa 1 nmol/L erreicht werden.

Drittens ist in realen Proben nicht nur die Nachweisempfindlichkeit entscheidend, wenn es um die niedrigste nachweisbare Konzentration geht. Ebenso wichtig ist die Selektivität bzw. die Trennung der relevanten Neurotransmitter von anderen Komponenten in der Probe. Daher wurden für die Trennung Hochleistungs-UHPLC-Säulen gewählt. Trennleistungen (Bodenzahlen) von 200.000 /m haben sich als machbar erwiesen.

Es gibt jedoch schwierige Fälle, in denen die Peaks zusammen eluieren oder in denen hohe und extrem niedrige Konzentrationen von Substanzen eng beieinander liegen. Es wurde eine zweite Kanal- oder Zweikanalkonfiguration (DCC) entwickelt, bei der zwei einzelne HPLC-Methoden denselben Probeninjektor mit zwei Injektionsschleifen verwenden. Dieselbe Probe kann gleichzeitig unter zwei völlig unterschiedlichen HPLC-Bedingungen analysiert werden. Bei der Analyse der Monoamin-Neurotransmitter einschließlich der sauren Metaboliten Homovanillinsäure (HVA), 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA) und 3,4-Dihydroxyphenylessigsäure (DOPAC) wird eine hervorragende Trennung und Quantifizierung aller relevanten Substanzen unter sauren (Kanal 1) und neutralen pH-Bedingungen (Kanal 2) erreicht.

Die vierte Anforderung – ein Wunsch in vielen Fällen – ist eine kurze Analysezeit oder die Geschwindigkeit der Analyse. Die Einführung von UHPLC-Säulen und -Instrumenten hat in dieser Hinsicht einen entscheidenden Wandel bewirkt. Eine Analysezeit von weniger als 2 Minuten für Dopamin und Serotonin in Dialyseproben gilt inzwischen als “normal”. Die Analyse von GABA und Glutamat erfolgt in einem vollautomatischen Derivatisierungsschritt. Durch die Entwicklung einer Methode mit Säulenwaschung zur Beseitigung spät eluierender Interferenzen konnte die Gesamtlaufzeit erheblich verkürzt werden.

Es wurde eine Reihe von Methoden entwickelt, um die Vielseitigkeit des ALEXYS-Systems zu veranschaulichen. Die Methoden für 3-Hydroxykynurenin (3-HK) und die Fruchtfliegen-Neurotransmitter Octopamin, Tyrosin, Tryptophan und Tyramin basieren auf den Monoaminmethoden. Die Analyse mehrerer großer neutraler Aminosäuren (LNAAs – Vorläufer verschiedener Neurotransmitter im Gehirn) wurde mit dem automatisierten OPA-Verfahren durchgeführt, ähnlich wie bei GABA und Glutamat. Aminothiole und Glutathion spielen eine Rolle beim antioxidativen Schutz des Gehirns und bei neurodegenerativen Erkrankungen. Sie werden mit dem ALEXYS mit einer Durchflusszelle mit einer bordotierten Diamantelektrode analysiert. Die Applikationen können kostenlos heruntergeladen werden.