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Was ist HPLC?

Was ist HPLC?

HPLC oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist eine Analysetechnik zur Identifizierung und Quantifizierung von Substanzen in einer Lösung. Es kann zur Messung der Konzentration von Kohlenhydraten in Lebensmitteln und Getränken, von Pestiziden in Oberflächenwasser für die Umweltanalyse oder von Katecholaminen im Urin für klinische Zwecke eingesetzt werden, um nur einige Beispiele zu nennen.

Die UHPLC (U steht für ‘ultra’) beruht auf demselben Prinzip, es werden lediglich neuere, effizientere Chromatographiesäulen verwendet. UHPLC-Säulen sind mit kleineren Partikeln mit besserer Trennleistung gefüllt. Wegen der engen Kanäle zwischen kleinen Partikeln ist der Druck in einem solchen System höher. Aus diesem Grund sind oft spezielle Instrumente erforderlich.

Ein HPLC-System mit einer Pumpe mit Flaschen für die mobile Phase auf der linken Seite, einem Autosampler und einem Detektor (rechts).

Wie funktioniert die HPLC?

Ein HPLC-System besteht aus einer oder mehreren Pumpen, einem Autosampler, einem Detektor und einer Datenerfassungssoftware. Das Herzstück des HPLC-Systems ist eine mit Partikeln der stationären Phase gefüllte chromatographische Säule, in der die Trennung der Substanzen in einem Gemisch erfolgt. Die Instrumente sind durch Schläuche verbunden, die als Durchflussweg bezeichnet werden. Die Pumpe(n) fördern eine Trägerlösung oder mobile Phase durch den Flussweg des Systems. Die zu analysierende Probe wird über einen Autosampler in den Flussweg eingebracht. Normalerweise liegt die Flussrate bei den meisten HPLC-Geräten zwischen 0,05 und 2 mL/min. Der Druck im System hängt hauptsächlich von der Partikelgröße der stationären Phase, der Säulenlänge und der Flussrate ab. Typische Drücke in der HPLC liegen zwischen 100 und 400 bar.

Das Trennungsprinzip der HPLC beruht auf der Verteilung des Analyten zwischen der stationären Phase (mit Partikeln gefüllte Säule) und der mobilen Phase (durchfließendes Lösungsmittel). In einem gut funktionierenden HPLC-System ist die Verweildauer in der Säule für jeden Stoff im Gemisch einzigartig. Diese “Retentionszeit” identifiziert die Substanz. Bei der Umkehrphasenchromatographie werden unpolare stationäre Phasenpartikel verwendet. Infolgedessen haben die weniger polaren Substanzen eine stärkere Wechselwirkung und verbringen mehr Zeit in der Säule als polare Substanzen.

Der Detektor misst kontinuierlich die mobile Phase, die durch die Detektionszelle fließt. Substanzen, die aus der Säule eluieren, führen zu einer Ablenkung des Signals in Form eines Gauß-Peaks. Das Signal wird von einer Datenerfassungssoftware auf einem PC, der an den Detektor angeschlossen ist, gespeichert und in einem Chromatogramm ausgewertet.

Schematische HPLC-Konfiguration, das Injektionsventil ist Teil eines Autosamplers.

Drei Schnappschüsse in der Zeit, während ein Gemisch durch eine Säule transportiert wird. Zu Beginn (links) gibt es keine Trennung. Wenn der Probenstöpsel sich weiter durch den Flussweg bewegt, werden die Substanzen (∆ und ●) getrennt.

Was ist ein Chromatogramm?

Ein Chromatogramm ist ein Diagramm, das die Daten enthält, die von einem HPLC-Detektor durch eine Datenerfassungssoftware erfasst werden. Die Daten werden in einer Datei gespeichert, sie enthält das Signal und die Retentionszeit eines chromatographischen Laufs. Oft wird eine ganze Reihe von Chromatogrammen nacheinander erstellt, die die Analysen von Proben und Standards zur Kalibrierung enthalten. Diese Informationen werden zur Identifizierung und Quantifizierung verwendet, dem eigentlichen Ziel der Analyse. Mit Hilfe von Kalibrierstandards wird die Signalhöhe mit der Konzentration in Beziehung gesetzt und die Retentionszeit identifiziert eine Substanz in unbekannten Proben.

Es ist darauf zu achten, dass der im Probenchromatogramm gemessene Peak nicht mit anderen Substanzen mit der gleichen Retentionszeit ko-eluiert ist. Diese und andere Prüfungen sind Teil einer Assay-Validierung.

Ein Chromatogramm mit Kalibrierstandards verschiedener Neurotransmitter.