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Reduktion der Disulfidbindung in Proteinen

ROXY-Reaktoren für die Reduktion von Disulfidbindungen

  • Schnelle und sanfte Reduktion
  • Ersetzen von (harter) Nasschemie
  • Keine Gefahr der Ionenunterdrückung
  • Überlegene S-S-Anleiheabtretung

Disulfidbindungen sind eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen von Proteinen. Sie stabilisieren die 3D-Struktur des Proteins und sind entscheidend für dessen biologische Funktion. Die Reduktion von intra- und intermolekularen Disulfidbindungen ist für eine erfolgreiche Charakterisierung und Zuordnung der Bindungsstellen durch MS erforderlich. Die Offline-Reduktion erfolgt mit hochkonzentrierten chemischen Mitteln, z . B. Dithiothreitol (DTT), das vor der LC/MS-Analyse entfernt werden muss. Alternativ können auch thiolfreie Reduktionsmittel wie TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin) verwendet werden. Die Probenvorbereitung ist jedoch nach wie vor aufwändig und lässt sich nur schwer mit der Online-LC/MS kombinieren. Darüber hinaus kann die Möglichkeit der Online-Reduktion von Disulfidbindungen für die Bestimmung von Disulfidbindungsanordnungen oder für die Top-Down-Proteomics-Strategie von Vorteil sein, die auf der Fragmentierung intakter Proteine ohne enzymatischen Verdau beruht.

Schließlich zeigt die Verwendung von (LC)/EC/MS großes Potenzial für die schnelle Zuordnung von S-S-Bindungen in Biopharmazeutika. Das ROXY EC- und ROXY EC/LC-System mit seinen proprietären Elektroden auf Titanbasis sind die idealen Instrumente zur Durchführung solcher Studien.

Elektrochemisch unterstützte Reduktion von Disulfidbindungen in Insulin

Insulin, ein kleines Protein von 5733 Da, wird als Modellverbindung für die S-S-Reduktion verwendet. Es besteht aus 51 Aminosäuren, die zwei Ketten, A und B, bilden, und enthält 3 Disulfidbindungen. Zwei S-S-Bindungen zwischen den Ketten, die die Ketten A und B verbinden, und eine S-S-Bindung innerhalb der Kette, die sich in der Kette A befindet.

 

Eine fast vollständige Reduktion aller drei S-S-Bindungen in Insulin wurde mit dem ROXY EC System up-front MS erreicht.

Das Aufbrechen einer Disulfidbindung in einem elektrochemischen Durchflussreaktor erfordert ein Potenzial von etwa -1 V.