¿Qué es la HPLC?
¿Qué es la HPLC?
La HPLC o cromatografía líquida de alta resolución es una técnica analítica para identificar y cuantificar sustancias en una solución. Puede aplicarse para medir la concentración de hidratos de carbono en alimentos y bebidas, pesticidas en aguas superficiales para análisis medioambientales o catecolaminas en orina con fines clínicos, por citar algunos ejemplos.
La UHPLC (U significa “ultra”) se basa en el mismo principio, sólo que se aplican columnas cromatográficas más nuevas y eficaces. Las columnas de UHPLC se rellenan con partículas más pequeñas con un mejor rendimiento de separación. Debido a la estrechez de los canales entre las partículas pequeñas, la presión en dicho sistema es mayor. Por eso, a menudo se necesitan instrumentos especiales.
Un sistema HPLC con, a la izquierda, una bomba con botellas de fase móvil, un automuestreador y un detector (derecha).
¿Cómo funciona la HPLC?
Un sistema HPLC consta de una o varias bombas, un automuestreador, un detector y un software de adquisición de datos. En el corazón del sistema HPLC hay una columna cromatográfica, llena de partículas de fase estacionaria, donde tiene lugar la separación de las sustancias de una mezcla. Los instrumentos están conectados mediante tubos, denominados conductos de flujo. La(s) bomba(s) suministra(n) una solución portadora, o fase móvil, a través de la trayectoria de flujo del sistema. La muestra que se va a analizar se introduce en la vía de flujo mediante un automuestreador. Normalmente, el caudal en la mayoría de los HPLC está entre 0,05 – 2 mL/min. La presión en el sistema depende sobre todo del tamaño de las partículas de la fase estacionaria, de la longitud de la columna y del caudal. Las presiones típicas en HPLC son de 100 a 400 bares.
El principio de separación en HPLC se basa en la distribución del analito entre la fase estacionaria (columna llena de partículas) y la fase móvil (disolvente que fluye a través). En un sistema HPLC que funcione correctamente, el tiempo de permanencia en la columna es único para cada sustancia de la mezcla. Este “tiempo de retención” identifica la sustancia. En la cromatografía de fase inversa se utilizan partículas de fase estacionaria no polares. Como resultado, las sustancias menos polares tienen una interacción más fuerte y pasan más tiempo en la columna que las sustancias polares.
El detector mide continuamente la fase móvil que fluye a través de la célula de detección. Las sustancias que eluyen de la columna provocan una desviación de la señal, en forma de pico gaussiano. La señal se almacena y se analiza en un cromatograma mediante un software de adquisición de datos en un PC que está conectado al detector.
Configuración esquemática de HPLC, la válvula de inyección forma parte de un automuestreador.
Tres instantáneas en el tiempo mientras una mezcla es transportada a través de una columna. Al principio (izquierda), no hay separación. Cuando el tapón de muestra se desplaza más abajo en el recorrido del flujo, las sustancias (∆ y ●) se separan.
¿Qué es un cromatograma?
Un cromatograma es un gráfico que contiene los datos recogidos de un detector de HPLC por el software de adquisición de datos. Los datos se almacenan en un archivo, que contiene la señal y el tiempo de retención de una corrida cromatográfica. A menudo se obtienen en una secuencia un montón de cromatogramas que contienen los análisis de las muestras y los patrones para la calibración. Esta información se utiliza para la identificación y cuantificación, el objetivo último del análisis. Utilizando patrones de calibración, la altura de la señal se relaciona con la concentración y el tiempo de retención identifica una sustancia en muestras desconocidas.
Debe tenerse cuidado de que el pico medido en el cromatograma de la muestra no coeluya con otras sustancias con el mismo tiempo de retención. Esta y otras comprobaciones forman parte de la validación de un ensayo.
Cromatograma con patrones de calibración de varios neurotransmisores.