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Überlegenes HDX-MS

Überlegenes HDX-MS

Elektrochemische Reduktion von Biopharmazeutika

  • Schnelle und effiziente Reduktion von Disulfidbindungen
  • Erhöhte Sequenzabdeckung in HDX/MS
  • Verbesserte Charakterisierung der Scharnierregion von Antikörpern, Cystin-Knoten und anderen cystinreichen Proteinen
  • Keine Auswirkungen auf den Rücktausch
  • Elektronen anstelle von giftigen Chemikalien

Der Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) wird zur Untersuchung der Tertiärstruktur von Proteinen oder der Proteinfaltung eingesetzt. In den äußeren Bereichen des gefalteten Proteins findet ein leichter Austausch von Wasserstoff (H) durch Deuterium (D) statt. In den nächsten Schritten des Arbeitsablaufs werden die Proteine entfaltet und die Aminosäuresequenz wird durch MS aufgeklärt. Aminosäuren mit Deuterium sind natürlich aus der äußeren Region des gefalteten Proteins. Für zuverlässige Ergebnisse ist es wichtig, dass die H/D-Austauschreaktion gestoppt (gequencht) wird und die Veränderungen erhalten bleiben, sobald die Entfaltung der Proteine und die folgenden Schritte stattfinden.

Die kontrollierte elektrochemische Reduktion der S-S-Bindungen wurde erfolgreich für die Entfaltung größerer Proteine wie z. B. Antikörper eingesetzt und ersetzt die harte chemische Reduktion, die oft den H/D-Austausch gefährdet. Die Verwendung klassischer Reduktionsmittel wie DTT oder TCEP ist unter Quenching-Bedingungen (saurer pH-Wert und niedrige Temperatur) oft unwirksam. Daher eröffnet der Einsatz von ROXY EC mit seinen proprietären Elektroden auf Titanbasis für die sanfte und kontrollierte Spaltung der S-S-Bindung neue Möglichkeiten in HDX/MS-Workflows, die zu einer deutlich höheren Sequenzabdeckung führen.

Die beiden Abbildungen zeigen die Sequenzabdeckung für Nervenwachstumsfaktor-β mit chemischer und elektrochemischer (EC) Reduktion. Die Integration der elektrochemischen Durchflusszelle in den HDX/MS-Arbeitsablauf führte zu einer viel höheren Sequenzabdeckung als bei der chemischen Reduktion (99 % gegenüber 46 %) und ermöglichte eine viel umfassendere Charakterisierung des NGF. Angepasst von Trajberg E. et al., Anal. Chem.87 (2015) 8880.

Deuterierung und anschließende Reduktion der Disulfidbindungen im Arbeitsablauf von HDX-MS.

Sequenzabdeckung, unter Verwendung eines Arbeitsablaufs mit chemischer (TCEP) Reduktion.
Sequenzabdeckung, unter Verwendung eines Arbeitsablaufs mit elektrochemischer Reduktion.