Che cos’è l’HPLC?
L’HPLC o cromatografia liquida ad alte prestazioni è una tecnica analitica per identificare e quantificare le sostanze in una soluzione. Può essere applicato per misurare la concentrazione di carboidrati negli alimenti e nelle bevande, di pesticidi nelle acque di superficie per l’analisi ambientale o di catecolamine nelle urine per scopi clinici, per citarne alcuni.
L’UHPLC (U sta per “ultra”) si basa sullo stesso principio, solo che vengono applicate colonne cromatografiche più nuove ed efficienti. Le colonne UHPLC sono riempite con particelle più piccole con migliori prestazioni di separazione. A causa dei canali stretti tra le piccole particelle, la pressione in questo sistema è più elevata. Per questo motivo, spesso sono necessari strumenti speciali.
Un sistema HPLC con a sinistra una pompa con bottiglie di fase mobile, un autocampionatore e un rivelatore (a destra).
Come funziona l’HPLC?
Un sistema HPLC è costituito da una o più pompe, un autocampionatore, un rivelatore e un software di acquisizione dati. Il cuore del sistema HPLC è una colonna cromatografica, riempita con particelle di fase stazionaria, dove avviene la separazione delle sostanze in una miscela. Gli strumenti sono collegati da un tubo, chiamato percorso di flusso. Le pompe forniscono una soluzione carrier, o fase mobile, attraverso il percorso di flusso del sistema. Il campione da analizzare viene introdotto nel percorso di flusso da un autocampionatore. In genere, la velocità di flusso nella maggior parte degli HPLC è compresa tra 0,05 e 2 mL/min. La pressione nel sistema dipende principalmente dalle dimensioni delle particelle della fase stazionaria, dalla lunghezza della colonna e dalla portata. Le pressioni tipiche dell’HPLC vanno da 100 a 400 bar.
Il principio di separazione in HPLC si basa sulla distribuzione dell’analita tra la fase stazionaria (colonna riempita di particelle) e la fase mobile (solvente che scorre). In un sistema HPLC ben funzionante, il tempo trascorso nella colonna è unico per ogni sostanza della miscela. Questo “tempo di ritenzione” identifica la sostanza. Nella cromatografia in fase inversa si utilizzano particelle in fase stazionaria non polari. Di conseguenza, le sostanze meno polari hanno un’interazione più forte e trascorrono più tempo in colonna rispetto alle sostanze polari.
Il rivelatore misura continuamente la fase mobile che scorre attraverso la cella di rivelazione. Le sostanze che eluiscono dalla colonna provocano una deviazione del segnale, sotto forma di picco gaussiano. Il segnale viene memorizzato e analizzato in un cromatogramma dal software di acquisizione dati su un PC collegato al rivelatore.
Schema della configurazione HPLC, la valvola di iniezione fa parte di un autocampionatore.
Tre istantanee nel tempo mentre una miscela viene trasportata attraverso una colonna. All’inizio (a sinistra), non c’è separazione. Quando la massa del campione si sposta lungo il percorso del flusso, le sostanze (∆ e ●) vengono separate.
Che cos’è un cromatogramma?
Un cromatogramma è un grafico che contiene i dati raccolti da un rivelatore HPLC dal software di acquisizione dati. I dati vengono memorizzati in un file che contiene il segnale e il tempo di ritenzione di una corsa cromatografica. Spesso si ottiene un intero gruppo di cromatogrammi in sequenza, contenenti le analisi dei campioni e degli standard per la calibrazione. Queste informazioni vengono utilizzate per l’identificazione e la quantificazione, l’obiettivo finale dell’analisi. Utilizzando gli standard di calibrazione, l’altezza del segnale è correlata alla concentrazione e il tempo di ritenzione identifica una sostanza in campioni sconosciuti.
Occorre prestare attenzione che il picco misurato nel cromatogramma del campione non sia in co-eluizione con altre sostanze con lo stesso tempo di ritenzione. Questo e altri controlli fanno parte della validazione di un saggio.
Un cromatogramma con standard di calibrazione di diversi neurotrasmettitori.