Neurotransmisores

El Analizador de Neurotransmisores ALEXYS ha sido desarrollado para el análisis de muestras de tejido cerebral, mosca de la fruta o microdiálisis. Nuestras notas de aplicación describen los retos a los que nos enfrentamos y un historial probado de publicaciones bibliográficas nos da la razón. El ALEXYS se basa en UHPLC con detección electroquímica con un par de características únicas que lo hacen adecuado para la investigación en neurociencia. El proceso de desarrollo consistió en eliminar cuellos de botella y mejorar el rendimiento del sistema hasta lo que es ahora.

En primer lugar, el sistema debe ser adecuado para manipular muestras de pequeño volumen. Esto es especialmente importante para las muestras de microdiálisis. En la microdiálisis cerebral se toman muestras de líquido extracelular mediante una sonda y se recogen fracciones para su posterior análisis. Los caudales típicos en microdiálisis son de 1 – 2 µL/min, la disminución del tamaño de la fracción a unos pocos microlitros permite una resolución temporal de unos pocos minutos. En el automuestreador ALEXYS, se han desarrollado procedimientos de inyección para recoger 5 de un total de 7 µl de volumen de muestra. Y mediante el uso de microdiálisis en línea, es posible analizar fracciones de 2 µl directamente desde la sonda de muestra utilizando únicamente una válvula de muestra. No es necesario recogerlo primero en viales y utilizar un automuestreador para inyectarlo. Esto hace factible una resolución temporal de sólo 1 minuto.

En segundo lugar, el sistema debe tener una sensibilidad excelente para poder cuantificar concentraciones extremadamente bajas de determinados neurotransmisores. La ALEXYS utiliza una célula de flujo de tipo chorro de pared con espaciado ajustable, la SenCell. Se han notificado límites de detección de hasta 20 pmol/L para la dopamina, la serotonina y la noradrenalina (0,1 fmole). Para la acetilcolina se realiza un paso intermedio con un reactor enzimático postcolumna, y se puede obtener un límite de detección de aproximadamente 1 nmol/L.

En tercer lugar, en las muestras de la vida real la sensibilidad de detección no es lo único que importa, cuando se trata de la concentración detectable más baja. La selectividad o separación de los neurotransmisores relevantes de otros componentes de la muestra es igualmente importante. Por lo tanto, se han seleccionado columnas UHPLC de alto rendimiento para la separación. Se ha demostrado que es posible lograr una eficacia de separación (número de placas) de 200.000 /m.

Sin embargo, hay casos difíciles en los que los picos coeluyen, o en los que concentraciones altas y extremadamente bajas de sustancias eluyen muy juntas. Se ha desarrollado un segundo canal o configuración de doble canal (DCC), con dos métodos HPLC individuales que utilizan el mismo inyector de muestra con dos bucles de inyección. La misma muestra puede analizarse simultáneamente en dos condiciones de HPLC totalmente diferentes. Al analizar los neurotransmisores monoamínicos, incluidos los metabolitos ácidos ácido homovanílico (HVA), ácido 5-hidroxiindol acético (5-HIAA) y ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC), se consigue una excelente separación y cuantificación de todas las sustancias relevantes en condiciones de pH ácido (canal 1) y neutro (canal 2).

El cuarto requisito -un deseo en muchos casos- es un tiempo de análisis breve o la rapidez del análisis. La introducción de columnas e instrumentos de UHPLC ha cambiado las reglas del juego en este sentido. Actualmente se considera «normal» un tiempo de análisis inferior a 2 minutos para la dopamina y la serotonina en muestras de diálisis. El análisis de GABA y glutamato se realiza mediante un paso de derivatización totalmente automatizado. Al desarrollar un método con un lavado de columna para eliminar las interferencias de elución tardía, el tiempo total de ejecución se ha reducido considerablemente.

Se han desarrollado varios métodos para ilustrar la versatilidad del sistema ALEXYS. Los métodos para la 3-hidroxicinurenina (3-HK) y los neurotransmisores de la mosca de la fruta octopamina, tirosina, triptófano y tiramina se basan en los métodos de las monoaminas. El análisis de varios aminoácidos neutros grandes (LNAA, precursores de varios neurotransmisores cerebrales) se ha realizado mediante el procedimiento automatizado OPA, similar al del GABA y el glutamato. Los aminotioles y el glutatión desempeñan un papel en la defensa antioxidante del cerebro y en las enfermedades neurodegenerativas. Se analizan utilizando el ALEXYS con una célula de flujo con un electrodo de diamante dopado con boro. Las notas de aplicación pueden descargarse gratuitamente.