Neurotrasmettitori

L’analizzatore di neurotrasmettitori ALEXYS è stato sviluppato per l’analisi di campioni di tessuto cerebrale, di moscerini della frutta o di microdialisi. Le nostre note applicative descrivono le sfide che abbiamo affrontato e una comprovata esperienza di pubblicazioni in letteratura dimostra la nostra tesi. L’ALEXYS si basa su UHPLC con rivelazione elettrochimica con alcune caratteristiche uniche che lo rendono adatto alla ricerca nelle neuroscienze. Il processo di sviluppo ha portato all’eliminazione d’impedimenti e al miglioramento delle prestazioni del sistema fino a raggiungere il livello attuale.

In primo luogo, il sistema deve essere adatto a gestire piccoli volumi di campione. Ciò è particolarmente importante per i campioni di microdialisi. Nella microdialisi cerebrale il fluido extracellulare viene campionato attraverso una sonda e le frazioni vengono raccolte per ulteriori analisi. Le velocità di flusso tipiche della microdialisi sono di 1 – 2 µL/min, e la riduzione della dimensione della frazione a pochi microlitri consente una risoluzione temporale di pochi minuti. Nell’autocampionatore ALEXYS sono state sviluppate procedure di iniezione per prelevare 5 dei 7 µL totali di volume di campione. Inoltre, utilizzando la microdialisi on-line, è possibile analizzare frazioni di 2 µL direttamente dalla sonda di campionamento utilizzando solo una valvola di campionamento. Non è necessario raccoglierlo prima in fiale e usare un autocampionatore per iniettarlo. Ciò rende fattibile una risoluzione temporale di solo 1 minuto.

In secondo luogo, il sistema deve avere un’eccellente sensibilità per poter quantificare concentrazioni estremamente basse di alcuni neurotrasmettitori. L’ALEXYS utilizza una cella a flusso di tipo wall jet con spaziatura regolabile, la SenCell. Sono stati riportati limiti di rilevazione fino a 20 pmol/L per dopamina, serotonina e noradrenalina (0,1 fmole). Per l’acetilcolina è previsto un passaggio intermedio con un reattore enzimatico postcolonna e si può ottenere un limite di rilevazione di circa 1 nmol/L.

In terzo luogo, nei campioni reali la sensibilità di rilevamento non è l’unica cosa che conta, quando si tratta della minima concentrazione rilevabile. La selettività o la separazione dei neurotrasmettitori rilevanti dagli altri componenti del campione è altrettanto importante. Pertanto, per la separazione sono state scelte colonne UHPLC ad alte prestazioni. È stato dimostrato che è possibile ottenere un’efficienza di separazione (numero di piastre) di 200.000 /m.

Tuttavia, ci sono casi difficili in cui i picchi si eluiscono insieme, o in cui concentrazioni elevate ed estremamente basse di sostanze eluiscono strettamente insieme. È stato sviluppato un secondo canale o configurazione a doppio canale (DCC), con due metodi HPLC individuali che utilizzano lo stesso iniettore di campioni con due loop di iniezione. Lo stesso campione può essere analizzato contemporaneamente in due condizioni HPLC completamente diverse. Per l’analisi dei neurotrasmettitori monoaminici, compresi i metaboliti acidi dell’acido omovanillico (HVA), dell’acido 5-idrossiindolo acetico (5-HIAA) e dell’acido 3,4-diidrossifenilacetico (DOPAC), si ottiene un’eccellente separazione e quantificazione di tutte le sostanze rilevanti in condizioni di pH acido (canale 1) e neutro (canale 2).

Il quarto requisito – un desiderio in molti casi – è un tempo di analisi breve o la velocità di analisi. L’introduzione di colonne e strumenti UHPLC ha cambiato le carte in tavola. Un tempo di analisi inferiore a 2 minuti per la dopamina e la serotonina nei campioni di dialisi è ora considerato “normale”. L’analisi di GABA e glutammato si avvale di una fase di derivatizzazione completamente automatizzata. Sviluppando un metodo con un lavaggio della colonna per eliminare le interferenze a eluizione tardiva, il tempo totale di esecuzione è stato ridotto in modo significativo.

Sono stati sviluppati diversi metodi per illustrare la versatilità del sistema ALEXYS. I metodi per la 3-idrossichinurenina (3-HK) e i neurotrasmettitori del moscerino della frutta octopamina, tirosina, triptofano e tiramina si basano sui metodi delle monoammine. L’analisi di diversi grandi amminoacidi neutri (LNAA – precursori di vari neurotrasmettitori cerebrali) è stata effettuata utilizzando la procedura automatizzata OPA, simile a quella del GABA e del glutammato. Gli aminotioli e il glutatione svolgono una ruolo nella difesa antiossidante del cervello e nelle malattie neurodegenerative. Vengono analizzati utilizzando l’ALEXYS con una cella a flusso con un elettrodo di diamante drogato di boro. Le note applicative sono scaricabili gratuitamente.