Qu’est-ce que l’HPLC ?

La HPLC ou chromatographie liquide à haute performance est une technique d’analyse permettant d’identifier et de quantifier des substances dans une solution. Il peut être appliqué pour mesurer la concentration de glucides dans les aliments et les boissons, de pesticides dans les eaux de surface pour l’analyse environnementale, ou de catécholamines dans l’urine à des fins cliniques, pour n’en citer que quelques-uns.

L’UHPLC (U pour « ultra ») repose sur le même principe, à ceci près que des colonnes chromatographiques plus récentes et plus efficaces sont utilisées. Les colonnes UHPLC sont remplies de particules plus petites offrant de meilleures performances de séparation. En raison des canaux étroits entre les petites particules, la pression dans un tel système est plus élevée. Pour cette raison, des instruments spéciaux sont souvent nécessaires.

Un système HPLC se compose d’une ou plusieurs pompes, d’un passeur d’échantillons, d’un détecteur et d’un logiciel d’acquisition de données. Au cœur du système HPLC se trouve une colonne chromatographique, remplie de particules de phase stationnaire, où s’effectue la séparation des substances dans un mélange. Les instruments sont reliés par un tube, appelé le chemin d’écoulement. La ou les pompes fournissent une solution porteuse, ou phase mobile, à travers le chemin d’écoulement du système. L’échantillon à analyser est introduit dans le circuit par un passeur automatique d’échantillons. Typiquement, le débit dans la plupart des HPLC est compris entre 0,05 et 2 mL/min. La pression dans le système dépend principalement de la taille des particules de la phase stationnaire, de la longueur de la colonne et du débit. Les pressions typiques en HPLC sont de 100 à 400 bars.

Le principe de séparation de la HPLC repose sur la répartition de l’analyte entre la phase stationnaire (colonne remplie de particules) et la phase mobile (solvant qui la traverse). Dans un système HPLC qui fonctionne bien, le temps passé dans la colonne est unique pour chaque substance du mélange. Ce « temps de rétention » permet d’identifier la substance. En chromatographie en phase inversée, on utilise des particules de phase stationnaire non polaires. Par conséquent, les substances moins polaires ont une interaction plus forte et passent plus de temps dans la colonne que les substances polaires.

Le détecteur mesure en permanence la phase mobile qui traverse la cellule de détection. Les substances qui s’éluent de la colonne entraînent une déviation du signal, sous la forme d’un pic gaussien. Le signal est stocké et analysé dans un chromatogramme par un logiciel d’acquisition de données sur un PC qui est connecté au détecteur.

Un chromatogramme est un graphique qui contient les données recueillies à partir d’un détecteur HPLC par un logiciel d’acquisition de données. Les données sont stockées dans un fichier, elles contiennent le signal et le temps de rétention d’un passage chromatographique. Souvent, on obtient toute une série de chromatogrammes dans une séquence, contenant les analyses d’échantillons et de standards pour la calibration. Ces informations sont utilisées pour l’identification et la quantification, le but ultime de l’analyse. En utilisant des normes d’étalonnage, la hauteur du signal est liée à la concentration et le temps de rétention permet d’identifier une substance dans des échantillons inconnus.

Il faut veiller à ce que le pic mesuré dans le chromatogramme de l’échantillon ne soit pas co-élué avec d’autres substances ayant le même temps de rétention. Cette vérification, ainsi que d’autres, font partie de la validation d’un essai.