Neurotransmetteurs

L’analyseur de neurotransmetteurs ALEXYS a été mis au point pour l’analyse d’échantillons de tissu cérébral, de mouche à fruits ou de microdialyse. Nos notes d’application décrivent les défis auxquels nous avons été confrontés et nos publications prouvent que nous avons fait nos preuves. L’ALEXYS est basé sur une UHPLC avec détection électrochimique et présente quelques caractéristiques uniques qui le rendent adapté à la recherche en neurosciences. Le processus de développement a consisté à éliminer les goulets d’étranglement et à améliorer les performances du système jusqu’à ce qu’elles atteignent leur niveau actuel.

Tout d’abord, le système doit être adapté à la manipulation de petits volumes d’échantillons. Ceci est particulièrement important pour les échantillons de microdialyse. Dans la microdialyse cérébrale, le liquide extracellulaire est prélevé par une sonde et des fractions sont collectées pour une analyse ultérieure. Les débits typiques en microdialyse sont de 1 à 2 µL/min, la diminution de la taille de la fraction à quelques microlitres permet une résolution temporelle de quelques minutes. Dans le passeur d’échantillons ALEXYS, des procédures d’injection ont été développées pour prélever 5 échantillons sur un volume total de 7 µl. Et en utilisant la microdialyse en ligne, il est possible d’analyser des fractions de 2 µL directement à partir de la sonde d’échantillonnage en utilisant seulement une vanne d’échantillonnage. Il n’est pas nécessaire de le collecter d’abord dans des flacons et d’utiliser un échantillonneur automatique pour l’injecter. Cela rend possible une résolution temporelle de seulement 1 minute.

Deuxièmement, le système doit avoir une excellente sensibilité pour pouvoir quantifier des concentrations extrêmement faibles de certains neurotransmetteurs. L’ALEXYS utilise une cellule d’écoulement de type wall jet à espacement réglable, la SenCell. Des limites de détection allant jusqu’à 20 pmol/L pour la dopamine, la sérotonine et la noradrénaline ont été rapportées (0,1 fmole). Pour l’acétylcholine, une étape intermédiaire avec un réacteur enzymatique post-colonne est nécessaire, et une limite de détection d’environ 1 nmol/L peut être obtenue.

Troisièmement, dans les échantillons réels, la sensibilité de détection n’est pas la seule chose qui compte, lorsqu’il s’agit de la plus faible concentration détectable. La sélectivité ou la séparation des neurotransmetteurs pertinents des autres composants de l’échantillon est également importante. Par conséquent, des colonnes UHPLC à haute performance ont été sélectionnées pour la séparation. Des rendements de séparation (nombre de plaques) de 200 000 /m se sont avérés réalisables.

Il existe néanmoins des cas difficiles avec des pics co-élués, ou lorsque des concentrations élevées et extrêmement faibles de substances sont éluées de manière très proche. Une deuxième voie ou configuration à double voie (DCC) a été développée, avec deux méthodes HPLC individuelles utilisant le même injecteur d’échantillon avec deux boucles d’injection. Le même échantillon peut être analysé simultanément dans deux conditions HPLC totalement différentes. Lors de l’analyse des neurotransmetteurs monoamines, y compris les métabolites acides que sont l’acide homovanillique (HVA), l’acide 5-hydroxyindole acétique (5-HIAA) et l’acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (DOPAC), on obtient une excellente séparation et quantification de toutes les substances pertinentes dans des conditions de pH acide (canal 1) et neutre (canal 2).

La quatrième exigence – un souhait dans de nombreux cas – est un temps d’analyse court ou la rapidité de l’analyse. L’introduction des colonnes et des instruments UHPLC a changé la donne à cet égard. Un temps d’analyse de moins de 2 minutes pour la dopamine et la sérotonine dans les échantillons de dialyse est maintenant considéré comme « normal ». L’analyse du GABA et du glutamate utilise une étape de dérivatisation entièrement automatisée. En développant une méthode avec un lavage de la colonne pour se débarrasser des interférences à élution tardive, le temps total d’exécution a été considérablement réduit.

Un certain nombre de méthodes ont été développées pour illustrer la polyvalence du système ALEXYS. Les méthodes relatives à la 3-hydroxykynurénine (3-HK) et aux neurotransmetteurs de la mouche du vinaigre (octopamine, tyrosine, tryptophane et tyramine) sont basées sur les méthodes relatives aux monoamines. L’analyse de plusieurs grands acides aminés neutres (LNAA – précurseurs de divers neurotransmetteurs cérébraux) a été réalisée à l’aide de la procédure automatisée OPA, comme pour le GABA et le glutamate. Les aminothiols et le glutathion jouent un rôle important dans le développement de la santé. rôle dans la défense antioxydante du cerveau et les maladies neurodégénératives. Ils sont analysés à l’aide de l’ALEXYS avec une cellule à flux avec une électrode en diamant dopé au bore. Les notes d’application peuvent être téléchargées gratuitement.